Sevizi di laboratorio

Il laboratorio di biologia cellulare fornisce servizi avanzati nel campo della coltura cellulare, con competenze che spaziano dall’isolamento di cellule da tessuti specifici alla riprogrammazione e differenziamento di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC).

Tutti i materiali impiegati sono di qualità certificata e sottoposti a test preliminari prima dell’inserimento nel ciclo produttivo. Le metodiche operative, sviluppate e standardizzate internamente, vengono costantemente aggiornate grazie alla formazione continua del personale tecnico-scientifico.

Oltre a fornire consulenze specialistiche, il laboratorio è in grado di sviluppare servizi personalizzati in base alle specifiche esigenze del committente.

Isolamento e creazione di linee linfoblastoidi da sangue periferico

Le cellule mononucleate vengono isolate mediante gradiente di densità e successivamente immortalizzate tramite virus di Epstein-Barr (EBV). Le colture vengono espanse in assenza di antibiotici fino al raggiungimento di un numero sufficiente di cellule per la crioconservazione in DMSO e congelate mediante rampa di congelamento controllata.

Ogni stock è sottoposto a controlli di qualità per vitalità, sterilità (assenza di contaminazioni batteriche, fungine e da micoplasma) e genotipizzazione.

Controllo di qualità, caratterizzazione ed espansione di linee cellulari

Il laboratorio offre un’ampia gamma di test per la verifica della qualità delle colture cellulari, tra cui:

• test di vitalità mediante scongelamento e mantenimento in coltura;
• test di sterilità in assenza di antibiotici;
• inoculo su terreni specifici per identificazione di contaminazioni batteriche e fungine;
• controlli per cellule hiPSC (stabilità genomica, capacità proliferativa, pluripotenza);
• saggi per micoplasma mediante PCR.

È inoltre possibile produrre stock personalizzati in base a parametri concordati (numero di vials, concentrazione cellulare, crioprotettore, ecc.).

Espansione di cellule staminali adulte, fetali e tumorali

BioRep offre servizi di espansione e caratterizzazione di cellule staminali e tumorali.

Oltre ai controlli standard (vitalità e sterilità), possono essere effettuate analisi di marcatori di staminalità e saggi di differenziamento.

Su richiesta, è disponibile il servizio di cariotipizzazione in collaborazione con un laboratorio partner qualificato.

Generazione di cellule hiPSC

Il laboratorio fornisce servizi di riprogrammazione di cellule somatiche (PBMC o fibroblasti) provenienti da donatori sani o affetti da patologie (es. Parkinson, Alzheimer, SLA, diabete, ecc.).

Le linee hiPSC vengono sottoposte a controlli di sterilità, stabilità genomica, capacità proliferativa e pluripotenza, confermata tramite differenziamento in vitro e analisi molecolari e immunoistochimiche.

Differenziamento di cellule hiPSC

In base alle specifiche del cliente, BioRep può eseguire il differenziamento di cellule hiPSC in vari tipi cellulari.

Ogni linea differenziata è sottoposta a controlli di qualità e caratterizzazione fenotipica tramite analisi molecolari e immunoistochimiche.

BioRep offre servizi di biologia molecolare di alta qualità, tra cui purificazione di acidi nucleici, sequenziamento, genotipizzazione.

A partire da analisi eseguite su DNA e RNA tramite PCR (Polymerase Chain Reaction) e conseguente sequenziamento o separazione elettroforetica in base alle dimensioni dei frammenti degli acidi nucleici, i laboratori di biologia molecolare BioRep hanno ottimizzato una grande varietà di test genetici, permettendo analisi e studi che vanno dalla genetica molecolare e oncologia molecolare (test predittivo, diagnosi precoce) alla farmacogenetica (risposta individuale ed effetti collaterali dei farmaci), all’individuazione di marcatori genetici per malattie specifiche (trombofilia ereditaria).

Il personale BioRep è in grado di offrire un servizio completo di consulenza scientifica e tecnica per la creazione di metodi personalizzati per l’analisi degli acidi nucleici, che comprendono la purificazione degli acidi nucleici da diverse fonti, la scelta dei primers adeguati, l’amplificazione e l’analisi della sequenza finale.

Purificazione acidi nucleici

Il laboratorio è in grado di estrarre DNA (genomico, plasmidico) e RNA totale da diverse matrici biologiche (sangue, linee cellulari, saliva, tamponi buccali, tessuti paraffinati, microrganismi) con metodi manuali o automatizzati.

Sono inoltre disponibili metodi per la purificazione di microRNA a partire da sangue o da colture cellulari. Gli acidi nucleici ottenuti vengono sottoposti ad accurati controlli di qualità. In particolare RNA e microRNA sono analizzati su piattaforma microfluidica per determinare, ad esempio, l’integrità (RIN –RNA integrity number).

Gli acidi nucleici estratti possono essere successivamente aliquotati e preparati per la distribuzione ai ricercatori o conservati all’interno dell’area di BioRep dedicata allo stoccaggio.

Genotipizzazione, e Sequenziamento Sanger

La genotipizzazione viene applicata per analizzare le differenze genetiche tra individui o cellule. BioRep offre l’analisi di marcatori microsatelliti polimorfici attraverso l’amplificazione di DNA (PCR Polymerase Chain Reaction) e successiva elettroforesi capillare. Tale servizio ha trovato applicazione, ad esempio, in studi di zigosità tra gemelli, oppure nella verifica dell’identità di campioni pervenuti.

Oltre a questo è possibile indagare il numero di ripetizioni di determinate sequenze nucleotidiche note per essere associate a malattie genetiche (ad esempio la ripetizione della tripletta “CAG” legata alla malattia di Huntington).

La determinazione del sesso viene effettuata attraverso l’amplificazione (PCR) di una porzione del gene dell’Amelogenina e successiva elettroforesi capillare.
BioRep offre un servizio di sequenziamento del DNA con metodo Sanger, a partire da prodotti di amplificazione oppure da DNA plasmidico La reazione di sequenziamento utilizzata si basa sull’uso di terminatori marcati con fluorocromi e successiva elettroforesi capillare.

In base alle richieste possono essere effettuati sequenziamenti del singolo filamento di DNA o di entrambi. Il servizio può includere l’intero processo di preparazione del campione, ovvero l’estrazione del DNA di partenza, l’amplificazione e il successivo sequenziamento.

BioRep fornisce anche una serie di saggi e servizi di Real-Time PCR per dosaggio del DNA, analisi dell’espressione genica, ricerca di mutazioni e polimorfismi mediante chimiche appropriate (sonde TaqMan, KASP, SybrGreen).

Analisi microbiologiche

Attualmente il laboratorio di microbiologia esegue test di individuazione della contaminazione da micoplasma su linee cellulari.

Queste analisi sono basate su metodi molecolari (Real-Time PCR), in particolare si va ad amplificare la regione di genoma codificante il 16S rRNA attraverso l’uso di primers specifici. Questo permette di individuare la presenza di diverse specie di micoplasma.

Tale tecnica è altamente sensibile e richiede minime quantità di campione. È inoltre possibile effettuare identificazioni di batteri attraverso PCR o Real-time PCR.

Test ELISA

All’interno del laboratorio vengono svolti anche test ELISA per la quantificazione di ormoni, proteine e altre biomolecole.

Questa tecnica immunoenzimatica è altamente sensibile e specifica, rendendola ideale per analisi quantitative in ambito diagnostico e di ricerca.

BioRep fornisce anche servizi di sequenziamento di nuova generazione (NGS, Next Generation Sequencing) tramite piattaforme MiSeq e NextSeq550Dx di Illumina Inc., sia in ambito diagnostico che nella ricerca di base.

Il servizio utilizza una piattaforma Illumina ed include la preparazione di librerie, il sequenziamento e l’analisi bioinformatica per applicazioni quali: analisi dell’espressione differenziale di geni, ricerca di varianti genetiche, caratterizzazione di popolazioni microbiche.